olarak adlandırılan belirli bir nükleotid dizisine sahiptir. Kısıtlama enzimleri, tek ve çift sarmallı DNA'yı kesen enzimlerdir. Her kısıtlama enzimi, bir kısıtlama bölgesi olarak adlandırılan belirli bir nükleotid dizisine sahiptir; bu, onu tanır ve keser. Restriksiyon enzimleri, DNA dizilemesi, mutasyon analizi ve DNA'nın klonlanması ve çoğaltılması için kullanılır. Bilim adamları, ekspresyon vektörlerine, kromozomal DNA'dan ayrı olarak çoğalabilen DNA moleküllerine ilgi genleri eklemek için kısıtlama enzimleri kullanıyorlar. İlgili geni içeren vektör daha sonra proteinlerin tanımlanması ve tanımlanması için bir bakteri suşuna sokulabilir.
Günün Videosu
Adım 1
Bir kısıtlama haritasına bakarak vektörünüzdeki kısıtlama enzim yerlerini tanımlayın. Kısıtlama haritası hangi enzimlerin vektörünüzü keseceğini ve nerelerde kesileceğini söyleyecektir.
Adım 2
Ekleme sekansına bakarak gen eklemenizde bir siteye sahip olan bir kısıtlama enzimi seçin. Kısıtlama alanının, genin herhangi bir bölümünü kaybetmemek için, ilgi geninin dışındaki bir konumda olduğundan emin olun.
Adım 3
Gen eklentinizde veya vektörünüzde herhangi bir yerde kısıtlama yerinin kopyası olmadığından emin olun. Bu, DNA'nızda çoklu kesiklere neden olur ve yanıltıcı veriler verir.
Adım 4
Kör uçlardan ziyade yapışkan uçlarla kesilen kısıtlama enzimlerini seçmeye çalışın. Yapışkan uçlar, enzim, çift sarmallı DNA'yı kademeli olarak keserken ortaya çıkar ve aksi yönde kesilmiş bir kesici uçla tutturmayı kolaylaştıran tek sarmal bir çıkıntı bırakır. Kabarık uçlar, çift sarmallı DNA pürüzsüz bir şekilde kesildiğinde ortaya çıkar ve bunlar eklemek daha zordur.
Adım 5
Vektörün uygun yönde yerleştirildiğinden ve vektörün kendisine tekrar takılmadığından emin olmak için, REPLACEinizin her iki ucu için farklı bir kısıtlama enzimi seçin.
6. Adım
Aynı tampon sistemi ve sıcaklıkta iyi çalışan iki kısıtlama enzimi seçmeye çalışın. Bu mümkün değilse, her bir sindirimi ayrı ayrı çalıştırın.
İhtiyacınız Olabilecekler
- Gen ekleme sekansı
- Seçilen vektör için kısıtlama haritası
- Kısıtlama enzimlerinin listesi ve kesim siteleri
İpuçları
- Bazı web programları, kısıtlama bölgelerini hızla bir DNA sekansı üzerinde çoğaltmak. Böyle bir program New England BioLabs'dan alınmıştır.
